問：在用qEP做支原體檢測的時候，加入內控對照品，在儀器設置上是需要選擇兩個通道嗎？

答：是需要2個通道，一個FAM, 一個HEX，HEX是對應內控的通道。

問：我想問一下，7500儀器里面沒有HEX這個通道選項，可以用哪個通道代替呢？

答：7500這款是沒有HEX熒光標識，不過問過廠家，說7500有VIC，可以用VIC通道。

問：qPCR結果判定中，FAM positive，HEX irrelevant中這個不相關是具體指什么？

答：這個不相關是指如果FAM是陽性，那么由于擴增時存在競爭性抑制，所以內控是否有擴增，其無關緊要。

問：在用樣品制備試劑盒時，進行支原體DNA提取時，加入內控對照品，實際上是監(jiān)控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA，而無法監(jiān)測這步操作的回收率的，是嗎？

答：“實際上是監(jiān)控在提取操作總是否能夠binding支原體DNA”，可以這么理解，或者說是在監(jiān)測整個提取過程。我們又問了一下廠家，內控和樣品的提取效率是一樣的，這樣可以反映樣品的真實情況，因為只要內控提取后能測出來，那就表明提取是沒有問題的。極少量的支原體如10CFU的，通過提取，也是可以檢測到的，表明靈敏度是沒有問題的。樣本Ct值和10CFU的Ct值比較，是可以進行相對定量的。

問：你們好，我問一下你們這個Venor Gem qEP試劑盒能做放行檢測嗎?

答：放行應相當于國外說的release testing, 這個qEP試劑盒是符合國外藥典規(guī)定的性能，能做放行檢測的。同時需注意要做支原體DNA抽提才行，抽提是用另外一個盒子，見廠家的venor gem sample preparation kit。

問：這個如果是用來檢測細胞上清，是不是就不用提取DNA了呢？

答：只要是跟藥典有關，跟臨床治療或制藥檢驗有關，就需要提取DNA。如果僅僅是科研用培養(yǎng)細胞，篩查支原體，則可以不提。

問：詢問qPCR儀器的設置

答：具體可見MB廠家文件Venor^®GeM qEP: Cyclers Programming，可從網(wǎng)站上下載。

問：被動參比染料是選“none”吧？

答：對，沒有ROX，選none

問：大家好，想咨詢一下，咱們支原體DNA提取時所取的樣本量是依據(jù)什么定的呢，比如，我們有CAR-T細胞，病毒液等，如果CAR-T細胞按細胞數(shù)來的話取多少細胞數(shù)比較好，或者如果病毒液按體積的話多少體積更佳呢？

答：支原體 DNA 提取試劑盒可從多含有 1X 10⁶細胞/ml 的細胞上清中直接分離 DNA，病毒沒有要求?？傮w積多 200μl。提取的樣本就是細胞上清，ATMPs（高級醫(yī)用藥品），細胞培養(yǎng)基等。病毒液應該也是初來自細胞上清吧。樣本量是根據(jù)支原體污染量得出的經(jīng)驗值，跟核酸純化柱上的DNA膜吸附能力有關。

問：病毒液就是類似細胞上清的。如果體積大于200ul的話我們可以濃縮，但是這個體積有沒有一個上限呢？

答：體積有上限，是200 to 1000 µl, 可以參看經(jīng)典法試劑盒的那個說明書里對樣本處理那一塊。這個樣本量同時還考慮了靈敏度，使檢測達到很好的靈敏度。如果細胞數(shù)高于1X 10⁶細胞/ml ，那必須要先調細胞數(shù)了?；蛘邷p少樣本體積，總細胞數(shù)不超，也行。

問：您好，我這邊要提取10cfu對照品的基因組，10cfu對照品的說明書寫著用1ml基質重懸，基因提取試劑盒說一次上樣200μl進行提取，想問您一下，用200μl基質重懸10cfu可以嗎，想一次提完。

答：還是建議用1ml的基質重懸，因為靈敏度是以10CFU/ml為單位的。如果用200ul，濃度就高了。廠家建議10CFU標準品復溶了以后，要立即用完，不要再保存，擔心可能降解。

問：那1ml溶解的標準品，按提取試劑盒的要求，就得用多個管子一次提完對吧？

答：是的。

問：這個抽提試劑盒的收率有多少，是磁珠還是吸附柱？吸附柱的收率能有，因為以前我們用其他品牌的抽提試劑盒，收率只有百分之六，這樣的話，就存在假陰性結果的可能。

答：是吸附柱的方法。提取試劑盒的COA里，用的是很少量的支原體10CFU/ml，提取DNA后都可以檢測到。廠家來信說，產(chǎn)率依賴于DNA的類型（如GC含量，是基因組還是質粒）、操作者的技巧以及樣本基質的情況。因為這些情況，操作者很難達到生產(chǎn)商所給的比率，從而形成各種討論，因此產(chǎn)率沒寫到說明書里。

問：要檢測支原體的培養(yǎng)基中有酚紅，是否還需要抽提？

答：只要是在25ulPCR體系中加入的樣本量≤2ul，酚紅就不會對qPCR構成問題。更高濃度的酚紅會引起基線偏移，造成靈敏度降低。如果僅僅是篩查，則不需要抽提DNA。如果是做10CFU/ml的產(chǎn)品放行檢查，則需要抽提了。細胞基質的驗證總是要做的。

問：做qPCR，一個陰性對照Ct約為40，也有擴增曲線。是什么原因？

答：Ct值大于40可能是由于產(chǎn)生非特異性信號（如primer artefacts）以及極微小的污染所致。 但是，該結果是不具有可重復性的，因此結果仍然是陰性。

問：一步法的盒子的靈敏度是否總低于經(jīng)典法試劑盒？有沒有可能一步法的盒子也能檢測10CFU？

答：廠家回復如下：意思是一步法的樣本量為2ul用于支原體篩查，經(jīng)典法為10ul，用于產(chǎn)品的放行檢測。檢測10CFU的標準品非常具有挑戰(zhàn)性。一步法因為樣本量不夠，很難達到10CFU/ml。如果客戶想要包含DNA聚合酶的PCR試劑盒，可以選擇VenorGeM Classic G型試劑盒。它和經(jīng)典法（不含酶）的交叉驗證確實做過，顯示同樣的靈敏度。但全套的驗證沒有做過。

問：支原體10cfu標準品是干粉吧？ 配完后是多少體積？

答：是凍干粉，加基質液后是1ML體積。

問：基質液產(chǎn)品里帶嗎？

答：這個產(chǎn)品里不帶，是客戶自己要檢測哪類樣品，就用樣品里的基質液（例如用的哪個培養(yǎng)基）

問：PCR經(jīng)典法，跑膠時體現(xiàn)1條陽性帶，是否代表PCR經(jīng)典法可以檢測多種支原體，無法區(qū)分支原體種類。

答：PCR經(jīng)典法，跑膠時為1條陽性帶，無法區(qū)分支原體種類，需要將擴增產(chǎn)物測序鑒定。